评价脐带间充质干细胞移植前细胞活性的指标

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.016

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5847-5854.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.016

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评价脐带间充质干细胞移植前细胞活性的指标

雷鑫¹，陈彦²，张建林¹，崔蕾²，牛玉虎¹，牛勃¹

1山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市 030001
2山西医科大学第二附属医院呼吸科，山西省太原市 030001

收稿日期:2012-12-03 修回日期:2012-12-10 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 牛勃，博士，博士生导师，山西医科大学生物化学与分子生物学教研室，山西省太原市030001 niub2004@126.com
作者简介:雷鑫★，女，1987年生，山西省平遥县人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事间充质干细胞移植领域研究。 leejunkilx@sina.com

Evaluation indexes for the viability of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells before transplantation

Lei Xin¹, Chen Yan², Zhang Jian-lin¹, Cui Lei², Niu Yu-hu¹, Niu Bo¹

1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
2Department of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2012-12-03 Revised:2012-12-10 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Niu Bo, M.D., Doctoral supervisor, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China niub2004@126.com
About author:Lei Xin★, Studying for master’s degree, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China leejunkilx@sina.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：脐带间充质干细胞已在临床多种疾病中展开研究，作为一种动态的活细胞，移植前的细胞活性将直接影响治疗效果，锥虫蓝染色虽然是目前评价细胞活性的常用指标，但由于其易受主观因素的影响，并不能准确反映细胞功能状态。
目的：探寻可准确反映脐带间充质干细胞功能状态的活性指标。
方法：体外分离培养人脐带间充质干细胞，生理盐水4 ℃条件下保存0，2，4，6 h，采用多种具有代表性的细胞活性测定方法(锥虫蓝染色法、Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验)检测保存后细胞存活率，进一步观察它们与反映细胞功能状态指标克隆形成率之间的关联程度。
结果与结论：人脐带来源的间充质干细胞体外培养呈梭形贴壁生长，第3代细胞表面标记CD29、CD44与CD105表达呈现阳性，CD34与CD45表达呈现阴性，成脂及成骨诱导均表达阳性。锥虫蓝染色法得到的细胞活力与相应的克隆形成率相关性不大，而其他检测方法较锥虫蓝染色法而言相关性较好，其中以贴壁实验最为明显。证明了贴壁实验是目前反映细胞活性状态相对最为精确的指标。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 细胞移植, 体外, 细胞保存, 保存效果, 细胞活性, 细胞功能, 克隆形成, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells are gaining more attention in clinical treatments. Cell viability prior to transplantation has a direct impact on clinical prognosis. Despite trypan blue staining is a widely performed procedure to assess the viability of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, it cannot reflect the functional capacity of those cells accurately because of some subjective factors.
OBJECTIVE: To explore sensitive and accurate assay for the functions of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. Cultured umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were preserved in 0.9% saline for 0, 2, 4 and 6 hours at 4 ℃. Various methods (trypan blue staining, AnnexinV-PI, terminal deoxynucleotidyl transferase dutp nick end labeling, cell counting kit-8, live-dead assay, cell adherent assay) were used to determine the viability of post-storage umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, and the results were compared with colony-forming efficiency, a measure of cell function.
RESULTS AND CONCLUSION: Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured in vitro showed a spindle shape and attached growth, the third-generation umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were positive for CD29, CD44, CD105, and negative for CD 34 and CD 45. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells incubated in the adipogenic and osteogenic medium were both positive. Cell viability measured with trypan blue correlated moderately with colony-forming efficiency, while the percentage of viable cells measured with other methods correlated better with colony-forming efficiency, among which adherent assay was the most obvious. It is proved that cell adherent assay-measured viability is the most accurate indicator.

Key words: stem cells, umbilical cord/umbilical blood stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, cell transplantation, in vitro, cell preservation, preservation effect, cell viability, cell function, colony formation, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

雷鑫，陈彦，张建林，崔蕾，牛玉虎，牛勃 . 评价脐带间充质干细胞移植前细胞活性的指标[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5847-5854.

Lei Xin, Chen Yan, Zhang Jian-lin, Cui Lei, Niu Yu-hu, Niu Bo. Evaluation indexes for the viability of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells before transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5847-5854.

图/表（结果） 9

2.1 脐带间充质干细胞原代培养及生长情况 原代细胞培养24 h后，开始出现少量散在分布的单个贴壁细胞，形态呈现纺锤形、纤维样，之后细胞逐渐增生，培养至第7天时成为形态相对稳定的成纤维样长梭形细胞，呈螺旋状或漩涡状排列生长，10-12 d达到80%-90%融合，此时传代，细胞呈典型的漩涡状排列，见图1。

2.2 脐带间充质干细胞的表面标志 流式细胞仪检测发现脐带间充质干细胞高表达基质细胞与干细胞标记CD29、CD44与CD105，阳性率均90%以上，而低表达内皮与造血干细胞标记CD34与CD45，见图2。
2.3 向成脂和成骨方向诱导后细胞形态学观察 脐带间充质干细胞经诱导成脂培养14 d，胞浆内可见透明脂滴形成，油红O染色阳性；未加成脂诱导培养基的对照组细胞未见脂滴形成，油红O染色阴性，见图3。

脐带间充质干细胞诱导成骨培养21 d，细胞形态变为多角形，呈铺路石样外观，茜素红S染色，胞浆中有大量钙沉积；未加成骨诱导培养基的对照组细胞不能被茜素红染色，见图4。

2.4 不同活性方法检测脐带间充质干细胞的存活率 所采用的Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验5种活性检测方法得到的结果与锥虫蓝染色法得到的结果具有可比性，表明所选用的检测方法同传统的锥虫蓝染色法一样，可以用于细胞活力的测定，见图5。

2.5 不同检测方法对脐带间充质干细胞活性分析与集落形成率的比较 锥虫蓝染色法是目前科研与临床工作中常用于评估细胞活性的一种方法。在4 ℃条件下，经生理盐水保存0，2，4，6 h后测定脐带间充质干细胞的细胞活性及克隆形成率，结果见图6。经保存的脐带间充质干细胞存活率分别为(97.00±0.05)%，(94.95± 0.10)%，(91.56±0.06)%，(82.09±0.17)%，将其与反映细胞功能的指标克隆形成率进行相关性分析，可见二者的线性相关系数为0.925。

细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内侧迁移至脂质双层的外侧，Annexin V-PI流式细胞分析法就是利用Annexin V与磷脂酰丝氨酸具有高度亲和力的原理进行检测的。脐带间充质干细胞在4 ℃下经生理盐水保存0，2，4，6 h后，测定活细胞数及克隆形成率，见图7。对应时间点的细胞活性分别为(96.57±0.06)%，(94.01±0.09)%，(89.06±0.09)%，(79.41±0.08)%，克隆形成率与其之间的线性相关系数为0.950。

细胞凋亡时会发生染色体DNA的断裂，即产生3’-OH末端，将脱氧核糖核苷酸标记后加到3’-OH端从而进行检测，即为TUNEL法。如图8所示，在4 ℃条件下，经生理盐水保存0，2，4，6 h后脐带间充质干细胞的细胞活性分别为(96.24±0.13)%，(93.55±0.15)%，(88.61± 0.10)%，(79.36±0.05)%，此时细胞活性与克隆形成率之间的线性相关系数为0.956。

CCK-8法利用WST-8被细胞线粒体内的脱氢酶还原，生成可溶性的橙黄色formazan，颜色深浅与细胞数目呈线性关系。结果见图9，4 ℃条件下，经生理盐水保存0，2，4，6 h后，脐带间充质干细胞存活率分别为(96.34±0.07)%，(93.64±0.09)%，(88.91±0.15)%，(79.41±0.09)%，克隆形成率与其之间的线性相关系数为0.952。

Live-Dead Viability Assay主要利用细胞内酯酶及膜的完整性来检测细胞活性。如图10所示，4 ℃条件下，经生理盐水保存0，2，4，6 h后，脐带间充质干细胞活性分别为(95.84±0.09)%，(92.84±0.06)%，(87.60± 0.10)%，(78.92±0.09)%，克隆形成率与其之间的线性相关系数为0.966。

脐带间充质干细胞生存的第一步是具有贴壁性能。在4 ℃条件下，脐带间充质干细胞经生理盐水保存0，2，4，6 h后继续培养24 h后，计算细胞贴壁率。由图11可见，脐带间充质干细胞活性分别为(92.87±0.11)%，(87.56±0.08)%，(82.11±0.23)%，(75.75±0.09)%，细胞活性比例与克隆形成率二者之间的线性相关系数为0.988。

参考文献

[1] Lee JW, Fang X, Krasnodembskaya A, et al. Concise review: Mesenchymal stem cells for acute lung injury: role of paracrine soluble factors. Stem Cells. 2011;29(6):913-919.

[2] Semenov OV, Koestenbauer S, Riegel M, et al. Multipotent mesenchymal stem cells from human placenta: critical parameters for isolation and maintenance of stemness after isolation. Am J Obstet Gynecol. 2010;202(2):193.e1- 193.e13.

[3] Tran CT, Huynh DT, Gargiulo C,et al. In vitro culture of Keratinocytes from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: the Saigonese culture. Cell Tissue Bank. 2011; 12(2):125-133.

[4] Can A, Balci D. Isolation, culture, and characterization of human umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 2011;698:51-62.

[5] Singleton PA, Salgia R, Moreno-Vinasco L,et al. CD44 regulates hepatocyte growth factor-mediated vascular integrity. Role of c-Met, Tiam1/Rac1, dynamin 2, and cortactin. J Biol Chem. 2007;282(42):30643-30657.

[6] Mei SH, McCarter SD, Deng Y, et al. Prevention of LPS-induced acute lung injury in mice by mesenchymal stem cells overexpressing angiopoietin 1. PLoS Med. 2007;4(9):e269.

[7] Manning E, Pham S, Li S, et al. Interleukin-10 delivery via mesenchymal stem cells: a novel gene therapy approach to prevent lung ischemia-reperfusion injury. Hum Gene Ther. 2010;21(6):713-727.

[8] Olson AL, Swigris JJ. Idiopathic pulmonary fibrosis: diagnosis and epidemiology. Clin Chest Med. 2012;33(1):41-50.

[9] Cho PS, Messina DJ, Hirsh EL,et al. Immunogenicity of umbilical cord tissue derived cells. Blood. 2008;111(1):430- 438.

[10] La Rocca G, Anzalone R, Corrao S, et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 2009;131(2): 267-282.

[11] Venkataramana NK, Kumar SK, Balaraju S,et al. Open-labeled study of unilateral autologous bone-marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in Parkinson's disease.Transl Res. 2010;155(2):62-70.

[12] Garzón I, Pérez-Köhler B, Garrido-Gómez J, et al. Evaluation of the cell viability of human Wharton's jelly stem cells for use in cell therapy.Tissue Eng Part C Methods. 2012;18(6): 408-419.

[13] Rodriguez-Morata A, Garzon I, Alaminos M, et al. Cell viability and prostacyclin release in cultured human umbilical vein endothelial cells. Ann Vasc Surg. 2008;22(3):440-448.

[14] Mazaheri Z, Movahedin M, Rahbarizadeh F, et al. Different doses of bone morphogenetic protein 4 promote the expression of early germ cell-specific gene in bone marrow mesenchymal stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2011; 47(8):521-525.

[15] Sadan O, Shemesh N, Barzilay R,et al. Migration of neurotrophic factors-secreting mesenchymal stem cells toward a quinolinic acid lesion as viewed by magnetic resonance imaging.Stem Cells. 2008;26(10):2542-2551.

[16] Seeger FH, Tonn T, Krzossok N, et al. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. Eur Heart J. 2007;28(6):766-772.

[17] Mihu CM, Mihu D, Costin N, et al. Isolation and characterization of stem cells from the placenta and the umbilical cord. Rom J Morphol Embryol. 2008;49(4):441-446.

[18] Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M, et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2005;7(5):393-395.

[19] Heng BC, Cowan CM, Basu S.Temperature and calcium ions affect aggregation of mesenchymal stem cells in phosphate buffered saline.Cytotechnology. 2008;58(2):69-75.

[20] 卢润章,赵经慧,程梅,等.人脐带间充质干细胞体外培养的生物学特性研究[J].黑龙江医学,2013,37(2):81-83.

[21] 张芬熙,洪艳,梁文妹.人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究[J].贵阳医学院学报,2013,38(1):5-9,15.

[22] 赵庆华,祝加学,王雷,等.人脐带间充质干细胞的生物学特性及向软骨细胞、骨细胞分化实验研究[J].中华医学杂志,2011,91(5): 317-321.

[23] 孙丽,于丽,张华芳,等.人脐带间充质干细胞的分离培养及生物学特性[J].解剖科学进展,2011,17(2):131-134.

[24] Mazaheri Z, Movahedin M, Rahbarizadeh F,et al. Different doses of bone morphogenetic protein 4 promote the expression of early germ cell-specific gene in bone marrow mesenchymal stem cells.In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2011; 47(8):521-525.

[25] Guo RM, Cao N, Zhang F,et al.Controllable labelling of stem cells with a novel superparamagnetic iron oxide-loaded cationic nanovesicle for MR imaging. Eur Radiol. 2012;22(11): 2328-2337.

[26] Sun JH, Zhang YL, Qian SP,et al.Assessment of biological characteristics of mesenchymal stem cells labeled with superparamagnetic iron oxide particles in vitro.Mol Med Rep. 2012;5(2):317-320.

[27] Mascotti K, McCullough J, Burger SR. HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide.Transfusion. 2000;40(6):693-696.

[28] 刘阳,赖翼,李敏惠,等.流式细胞术检测细胞存活率的方法学建立[J].国际检验医学杂志,2011,32(15):1663-1664.

[29] Chan LL, Wilkinson AR, Paradis BD, et al. Rapid image-based cytometry for comparison of fluorescent viability staining methods. J Fluoresc. 2012;22(5):1301-1311.

[30] van der Bogt KE, Schrepfer S, Yu J, et al. Comparison of transplantation of adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the infarcted heart. Transplantation. 2009;87(5):642-652.

[31] Assmus B, Tonn T, Seeger FH, et al. Red blood cell contamination of the final cell product impairs the efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy. J Am Coll Cardiol. 2010;55(13):1385-1394.

[32] Song H, Cha MJ, Song BW, et al. Reactive oxygen species inhibit adhesion of mesenchymal stem cells implanted into ischemic myocardium via interference of focal adhesion complex. Stem Cells. 2010;28(3):555-563.

[33] Sarugaser R, Lickorish D, Baksh D,et al. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors.Stem Cells. 2005;23(2):220-229.

引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2011年9月至2012年8月在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室完成。

材料：

脐带组织：来源于山西医科大学第二医院产科提供的健康足月剖宫产新生儿。

产妇在生产前进行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒、梅毒螺旋体、支原体检测阴性，与孕妇签署知情同意书。

评估脐带间充质干细胞移植前细胞活性的主要试剂：

实验方法：

脐带间充质干细胞的分离与培养：取正常足月产健康婴儿脐带组织，浸泡于PBS中，超净台内取出脐带，PBS充分洗涤残余血渍，将脐带剪成1 cm左右的小段，剔除脐动静脉，并将其剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小组织块。将组织块移入15 mL离心管中，加入等体积0.1%胶原酶Ⅱ置于37 ℃恒温振荡仪内消化，直至组织块全部消化。将消化液移入无菌离心管中，加入PBS，反复吹打，1 500 r/min离心5 min，共洗涤3次。弃上清液，重新悬于含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液中，按 10⁸-10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于25 cm²细胞培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂的饱和湿度细胞培养箱内培养，4 d后首次半量换液，以后每3 d或4 d换液1次。倒置显微镜下观察，当细胞达70%-80%融合后，采用胰酶进行消化传代。

流式细胞仪测定脐带间充质干细胞表面标记：采用流式细胞仪对第3代间充质干细胞表面表型进行检测。0.25%胰酶消化待测细胞，PBS洗涤3次，制成5×10⁵细胞悬液。加入相应抗体，4 ℃避光孵育20 min，流式细胞仪分析各类抗原的阳性率。

脐带间充质干细胞的成骨细胞诱导和鉴定：取第3代间充质干细胞，以3×10⁴/孔接种于6孔板中，24 h贴壁后以成骨诱导分化完全培养基培养，每3 d更换1次培养基，诱导3周后进行茜素红S染色检测钙结节。

脐带间充质干细胞的成脂细胞诱导和鉴定：取第3代间充质干细胞，细胞以2×10⁴/孔接种于6孔板中培养，直至细胞达到100%融合，以成脂分化诱导培养基A液培养3 d，更换为成脂分化维持培养基B液，24 h后，重新更换为成脂分化诱导培养基A液，重复3个周期，继续在成脂分化维持培养基B液中维持3-5 d后进行油红O染色。

脐带间充质干细胞的保存：获取第3代脐带间充质干细胞，按实验要求消化后接种于6孔板，完全培养基正常培养，36 h后弃去正常培养基，生理盐水洗涤2遍，加入保存介质生理盐水在4 ℃条件下保存相应时间(0，2，4，6 h)，进行细胞活性与其功能的检测。

脐带间充质干细胞活性的检测：

锥虫蓝染色法：保存后的细胞经胰酶消化，制备成单细胞悬液，将细胞悬液与0.4%锥虫蓝溶液以9∶1混合混匀，3 min内于倒置相差显微镜下分别计数活细胞和死细胞。

Annexin V-PI：保存后的细胞以1 000 r/min离心 5 min，弃上清，每样品取5×10⁵细胞，向细胞中加入binding buffer 500 μL，Annexin V-FITC 5 μL，PI 5 μL，轻轻混匀，4 ℃避光反应5 min，流式细胞仪检测，以区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。

CCK-8：按每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板中，每孔加入CCK-8试剂10 μL，培养箱内孵育4 h。检测波长为450 nm，自动酶标测定仪检测各孔吸光度值。

Live-Dead Viability Assay：保存后的细胞以 1 000 r/min离心5 min，弃上清，每样品取5×10⁵细胞，用PBS清洗2次，加入工作液(4 μmol/L ethidium homodimer-1和2 μmol/L calcein AM)，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次，流式细胞仪检测。

TUNEL：将保存后的细胞进行涂片，自然晾干，用含体积分数为4%甲醛的PBS室温固定30 min，PBS漂洗2次，加入含体积分数为3%H₂O₂的甲醛，室温封闭10 min，PBS漂洗，浸入通透液中，冰上促渗2 min，PBS漂洗2次，滴加50 μL TdT酶反应液，加盖玻片37 ℃避光孵育60 min，PBS漂洗3次，滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，加盖玻片37 ℃避光孵育30 min，PBS漂洗3次，滴加50 μL DAB工作液，室温显色10 min，PBS漂洗3次，显微镜下观察。

贴壁实验：经保存后的细胞以1×10⁴/孔接种于24孔板中，培养箱内孵育24 h，弃去培养液，40 g/L多聚甲醛固定20 min，结晶紫染液100 μL染色15 min，PBS洗涤3次，倒置显微镜下计数。

脐带间充质干细胞功能的检测：

克隆形成能力的检测：经保存后的细胞悬浮于完全培养基中，以20×10³ L^-1接种于35 mm²皿中，培养箱孵育，3 d半量换液1次，14 d时终止培养，甲醛及结晶紫固定染色，计数集落(≥50个细胞)，按以下公式计算集落形成率。

主要观察指标：①倒置显微镜观察原代脐带间充质干细胞生长情况。②流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面标记的表达率。③脐带间充质干细胞成脂及成骨诱导后细胞形态变化及染色鉴定。④脐带间充质干细胞保存后的活性。⑤脐带间充质干细胞保存后的功能。

统计学分析：实验数据由第一作者采用SPSS 17.0软件包进行分析，数据以x(_)±s表示，进行两变量的相关性分析。

讨论

脐带间充质干细胞凭借其来源广泛，含量丰富，不受伦理限制等优势成为替代骨髓间充质干细胞的理想来源^[17]。大量的文献报道以及研究发现，脐带间充质干细胞符合间充质干细胞鉴定标准^[18]，同样具有高增殖能力、成骨成脂分化能力及高表达CD29，CD44，CD105表面标记与低表达CD34和CD45表面标记的特点^[19-22]。

虽然新鲜分离的脐带间充质干细胞进行即刻移植可获得最大的治疗效果，但由于脐带间充质干细胞培养需要在符合GMP的实验室进行，而移植过程则需要在具备资历的医院完成。因而脐带间充质干细胞移植前所经历的保存、运输、移植前手术等待等环节，明显延长了脐带间充质干细胞保存时间，进而可能引起细胞质量的改变，最终影响细胞治疗效果^[23]。因此，对保存后脐带间充质干细胞进行移植前活性测定十分必要，但目前尚无采用何种活力检测方法可准确反应细胞功能状态的相关指南及推荐，各个研究组通常采用经典锥虫蓝染色作为移植前细胞活性检测指标^[24-26]。

锥虫蓝染色是一种通过检测细胞膜完整性来评价细胞活性的指标，简单、快速、易行使其成为各种细胞检测活性的常用指标。然而，多个研究指出锥虫蓝染色指标并不能准确反映间充质干细胞功能状态^[27-28]，原因与其纯手工操作，影响检测稳定性有关。因而以锥虫蓝作为移植前活性测定指标并不能准确反映细胞活性状态，进而影响对临床应用的指导意义。

目前，细胞活性测定的方法已日渐增多，且原理各异。具有代表性的检测方法包括Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验。其中，CCK-8检测法通过对MTT比色法进行技术改良，克服了其生成不溶性蓝紫色化合物的缺点，从而具有较高的检测稳定性与灵敏度。Annexin V-PI流式细胞分析法采用的原理是：当细胞受到凋亡诱导后，磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧转移到外侧，通过检测细胞膜外侧的PS，进而检测早期凋亡时活细胞的比例。同时由于检测时样品通过荧光标记后直接上流式细胞仪，因此检测结果比较可靠。检测的时间通常在染色后1 h以内，否则时间一旦延长，细胞在缺乏培养基的条件下会逐渐发生凋亡，染色逐渐增强，即出现假阳性的结果。由于在细胞凋亡的早期，细胞形态尚未发生改变，只是DNA出现断裂，TUNEL法利用分子生物学与形态学相结合的原理，即可检测到断裂的DNA，从而检测出极少量的凋亡细胞，但由于在标记的过程中需要固定细胞，易造成细胞碎片过多或DNA片段的丢失，因此会出现假阳性的凋亡结果。Live/Dead法主要利用细胞内酯酶的活性来判断细胞的死活，理论上讲，并不是所有活细胞其酶代谢的水平均活跃，因此采用此种方法检测到的活细胞数目可能偏低。

尽管目前各检测方法均提高了其灵敏度与特异度，但是仍旧未能精确反应细胞活性，这与存在潜在的统计误差有关^[29]。一般情况下，如果按照标准流程操作，会存在5.8%-10%的统计误差。

由于脐带间充质干细胞移植前通常在生理盐水中保存一定时间^[30]，因此，在本项研究中，采用多种检测活性的方法(Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验)对生理盐水保存不同时间点的脐带间充质干细胞进行活力检测，将其与传统的锥虫蓝染色法比较。在保存0，2，4，6 h时，这些检测方法之间最大测量差值大约分别是4.13%，7.39%，9.45%，6.34%，说明每种测定方法同锥虫蓝染色法一样，可以用于检测细胞活性。

细胞克隆形成率是目前反映细胞功能的常用指标之一^[31]。采用锥虫蓝染色法测得的活细胞比例与细胞克隆形成率的相关系数为0.925，而其他的检测方法Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验测得的活细胞比例与细胞克隆形成率则具有较好的的相关性(分别为0.950，0.956，0.952，0.966，0.988)。以上结果表明，通过测定细胞克隆形成率，锥虫蓝确实过高的估计了细胞功能，其他检测方法则可以较之相对精确，而其中贴壁实验则是目前众多检测细胞活性方法中最为精确的。分析其原因可能是：反映细胞活力的指标包括细胞的生理状态和功能，而细胞的生理状态包括多个方面，它是一项综合指标，包括：细胞膜的选择通透性；细胞进行新陈代谢的能力，而此能力需要酶的参与；细胞通过遗传物质DNA的复制进行分裂增殖等。而目前常用的细胞活性检测方法大多只是针对细胞生理状态的一部分，并没有综合反映细胞的活性，因此最终均过高的估计了细胞活性，然而贴壁实验弥补了这一缺陷。由于脐带间充质干细胞是一种贴壁型细胞，因此其存活的前提就是细胞能够贴壁，进而增殖。一旦细胞与细胞之间或细胞与细胞外基质之间的黏附性缺失，则会影响生存信号的传递，进而引起了移植细胞的死亡，即所谓的失巢凋亡，最终影响了脐带间充质干细胞移植的疗效。因此脐带间充质干细胞贴壁性能的差异真实反映了其细胞活力的差异^[32]。由于在初始24 h内，为了适应环境，再次接种的细胞处于生长停滞期^[33]，因此为使保存后脐带间充质干细胞重新接种达到最大贴壁率，实验将重新接种后24 h作为观察的时间点。

脐带间充质干细胞移植前保存的过程中细胞质量的变化直接影响了临床治疗效果，实验证实了采用贴壁实验检测细胞活力最能准确反应细胞功能，是目前测定细胞活力相对最为精确的指标，为间充质干细胞在临床疾病治疗，改善患者病情评价方面提供重要的指导意义。实验不足之处在于时间的限制，未能研究除克隆形成能力之外的功能指标，另外，如何改善贴壁实验本身的主观性仍需进一步探讨，再者，贴壁实验是否可以很好的评价其他细胞移植前的活性还未知。

评价脐带间充质干细胞移植前细胞活性的指标

Evaluation indexes for the viability of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells before transplantation

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	刘志超, 张帆, 孙旗, 康晓乐, 袁巧妹, 柳根哲, 陈江. 不同静水压下人椎间盘髓核细胞的形态和活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1172-1176.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.